L'Ensemble nacque a Grosseto nel 1983 come coro polifonico inteso all'esecuzione di musica vocale del Rinascimento; l'iniziativa fu di alcuni studiosi della vocalità del '500, sostenuti da un gruppo di appassionati di musica e di canto. Nell'intento di ampliare il proprio repertorio e nello stesso tempo di indirizzarsi verso una resa vocale più raffinata, il sodalizio assume nel 1992 la struttura e il nome di Ensemble Polifonico; i cantori divennero un numero più limitato, ma la cura e l'attenzione verso una migliore qualità delle esecuzioni vennero concretamente privilegiate. L'attività dell'Ensemble si esplica attraverso due formazioni: il Gruppo Femminile e il Coro Misto. Il Gruppo Femminile indossava un costume riprodotto da un modello originale del '500, che contribuiva a creare una particolare atmosfera durante le esecuzioni. Il repertorio parte dal Canto Gregoriano e giunge fino al XXI secolo: Palestrina, Monteverdi, Di Lasso, De Victoria, Pergolesi, Mozart, Bach, Poulenc. Da alcuni anni e grazie all'impegno dell'attuale Maestro del Coro Massimo Merone, l'Ensemble Polifonico Palestrina ha allargato il proprio repertorio ad autori contemporanei di nuova avanguardia corale polifonica. L'Ensemble ha avuto modo di esibirsi in manifestazioni diverse, in numerose città italiane ed all'estero, in concerti sinfonici ed a cappella, in varie manifestazioni canore, tra le quali:
Nel 2019 l'Ensemble si è trasformato in APS, Associazione di Promozione Sociale ai sensi del D.Lgs. 117/2017